造福人类！世界首例神经疾病基因敲入猪诞生可为人类试药、用于干细胞的临床前评价

在广州九龙镇有一座 “猪宾馆”，生活着一群身娇肉贵的实验小猪，他们能精准地模拟人类的疾病。科学家利用基因“剪刀” CRISPR-Cas9，精准地把人突变的亨廷顿基因“粘贴（敲入）”到猪的亨廷顿基因中，从而使猪得了亨廷顿舞蹈病。广东科学家领衔的国际研究团队经过四年努力，首次利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9）和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪，精准地模拟出人类神经退行性疾病。

该项成果于北京时间3月30日在线发表在生物学顶尖学术期刊《细胞》上，该研究为开发治疗亨廷顿舞蹈病的新手段提供了稳定、可靠的动物模型，也为培育其它神经退行性疾病大动物模型提供了技术范本和理论依据。研究将推动我国发展出大动物疾病模型的医药研发产业链，也可用于干细胞治疗等手段的临床前评价，最终造福于人类。

中科院院士裴钢教授在得知该成果发表后指出，2008年，我们在制定发育与生殖研究国家重大科学研究计划"十二五"专项规划时,就前瞻性地布局了大型实验动物模型包括猪和猴的培育内容,并在后来的“干细胞国家重大科学研究计划”中持续加大经费投入。我国在基因编辑猴和克隆猴的研究中相继取得突破性成果，这次我国科学家在猪的疾病模型研究中又取得重大进展，表明我国在大动物模型的研究中已走在世界前列，将极大地推动我国生物医药产业的创新发展。

论文共同通讯作者为暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授、中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员、美国Emory大学李世华(Shihua Li)教授。

什么是亨廷顿舞蹈症？由单基因（HTT）突变导致的神经退性疾病

亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等是当今社会严重威胁人类健康的神经退行性疾病。这些疾病伴随年龄渐长而产生、可遗传、呈渐进性发展，由于缺乏合适的动物模型进行药物筛选，目前尚无有效的治疗方法。李晓江介绍，神经退行性疾病是致病蛋白变异后沉淀在神经细胞中，造成神经细胞功能紊乱，并引发神经细胞死亡，从而导致疾病发生。而亨廷顿舞蹈病是由单基因（HTT）突变导致的神经退性疾病。这是一个理想的疾病模式，可用于研究蛋白质错误折叠如何引起选择性的神经退性病变，是以后研究多基因突变病症的基础。

寻找合适的疾病实验模型 “夫妻档”科学家与猴做朋友

小鼠作为最常见的动物模型，已被广泛地用于研究人类疾病机理和寻找临床治疗方法。李晓江团队在研究中发现，表达突变基因的神经退行性疾病小鼠模型，并不能表现出像病人脑中一样的典型神经细胞死亡的重要病理特征。许多有治疗效果的药物在小鼠模型中有效，在临床上对病人往往无效。

为了探索动物模型，他开始把目光转移到大动物、非人灵长类动物身上。早在2008年，“夫妻档”科学家李晓江、李世华在美国Emory大学合作者的支持下，通过将外源性的突变基因引入到猕猴的体内，成功地建立了世界首只转基因亨廷顿病猴模型。李晓江说，在该模型中，可以明显地观察到相应的病理特征和行为变化，但表达外源性致病基因片段的毒性过强。实验中的转基因猴子基本在出生后较短时间内死亡，同时无法传代。因此，转基因亨廷顿病猴模型无法达到筛选治疗疾病的药物的目的。

为何选择猪？“猪八戒”成为科学家掌中宝

位于广州九龙镇的“猪宾馆”，记者看到，科学家们正精心饲养着一群身价不菲的实验小猪。与果蝇、线虫、小鼠等小型动物相比，猪被公认为是人类医学研究理想的大动物模型。赖良学解释，猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似，猪的体型大小和驯服习性允许进行反复采样和进行各种外科手术。

赖良学提到，与非人灵长类动物相比，猪的基因多样、繁殖周期短、一窝产仔多，便于根据特殊需要进行选育。所以，猪的疾病模型用于做药物筛选、人类疾病研究、干细胞治疗的研究结果，更容易转化为临床应用。作为华南地区重要的大动物疾病模型实验平台之一，赖良学团队先后建立了50余种在生物医药和农业领域具有重要价值的转基因和基因打靶克隆猪。2010年，这对“夫妻档”找到了赖良学，一拍即合，他们合作建立了首例转基因亨廷顿病模型猪。

大胆的科学设想 “基因魔剪”和克隆技术来帮忙

摆在科学家面前的是一个难题，与转基因亨廷顿病猴模型一样，猪模型也具有明显的表型特征，但不易存活，无法传代。这一问题，曾一度令他们感到非常困扰。李世华说，“人是在某个定点基因突变而导致亨廷顿疾病，而目前转基因技术是随机性的将外来的变异基因插入动物的基因组，其表达量也高于内源性致病基因。”团队进而分析，直接把猪的内源性基因改变为突变基因，猪的病理变化应该与病人的病理状态更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大动物中很难获得。2013年，随着基因编辑技术（CRISPR/Cas9）被广泛应用于哺乳动物中，在国家科技计划、国家自然科学基金委、国家重大研究计划、广东省科技计划等的大力支持下，他们大胆尝试这一科学设想，李世华着手应用Cas9技术来建立亨廷顿基因敲入猪模型。团队通力合作，利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9），将人突变的亨廷顿基因插入到猪的内源性亨廷顿基因的表达框中，即人外显子1中包含150 CAG重复序列精确地插入猪的HTT内源性基因中。能够成功关键还看实验进展，利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞，这并非一件易事，“单细胞逐个挑出来并进行筛选及鉴定，一定要挑选状态最好的细胞用来胚胎移植”。

负责此项实验工作的闫森先后筛选了上千个细胞，从中挑出确定带有突变基因且状态最好的细胞，闫森说，“每天早上7点进入细胞间，看细胞、换液、不停地跟细胞打交道，一抬头已是下午3点。好不容易筛选到的阳性克隆细胞如果状态不好又得重来，只有大量筛选才能获得最优的细胞克隆。很快，实验进入下一步，他们运用体细胞核移植技术进行克隆，成功培育带有突变基因的新生猪。在历经5个月的观察后，亨廷顿猪出现了运动障碍等渐进性发病的表型。下一步就是将稳定表达的基因敲入亨廷顿猪繁殖下去。由于疾病模型猪身体状态不好，在传代过程中更需要悉心的照料。终于在团队的呵护下F1代小猪出生了。为了证明亨廷顿基因敲入猪的病理特征更接近于人类。李世华多次从美国返回国内亲自指导实验，到猪场看小猪的生存环境及生活状态。

为人类试药 造福于人类

神经退行性疾病研究领域里程碑式的发现神经疾病基因敲入猪的成功，将推动我国发展出大动物疾病模型的医药研发产业链，促进针对阿尔茨海默病、帕金森症等神经退行性疾病，以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。同时，该动物模型可用于干细胞治疗等手段的临床前评价，最终造福于人类。

从事多年研究亨廷顿病的权威专家、美国加州大学洛杉矶分校杨向东(X. William Yang)教授指出，亨廷顿舞蹈病基因敲入猪的建立是神经退行性疾病研究领域中一个里程碑式的发现，使科学家能更深入了解神经细胞死亡的机制及寻找有效的治疗方法。

文：郭超豪

图：郭超豪

编辑：顾军

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